Nació el 15 de abril de 1452 en Vinci, en el valle del río Arno, la Toscana, territorio de los Medici y República de Florencia.
Hijo ilegítimo y primogénito del notario Piero Fruosino di Antonio da Vinci, y de Caterina, una campesina. Su bautismo tuvo lugar en la cercana iglesia parroquial de Santa Croce, pero tanto el padre como la madre no asistieron al no estar casados.
Leonardo no tuvo apellido en el sentido actual, y "da Vinci" simplemente significa "de Vinci": su nombre de nacimiento completo fue "Lionardo di ser Piero da Vinci". La inclusión del título de "ser" indica que su progenitor era un caballero. Su madre encontró un marido que aceptó su situación "comprometida".
Pasó sus primeros cinco años en la aldea de Anchiano en casa de su progenitora, y desde 1457, en casa de su padre y abuelos. En 1452, su padre Piero se había casado con Albiera Giovanni Amadori, de la que no tuvo hijos.
En 1460 se trasladó a Florencia, donde se formó. Su madrastra murió en 1464, cuando la familia ya vivía en Florencia, y fue enterrada en San Biagio. Ser Piero se casó tres veces más: en 1464, con Francesca di Ser Giuliano Lanfredini, que también murió sin descendencia; con Margherita di Francesco di Jacopo di Guglielmo, en 1475, que finalmente le dio seis hijos; otros seis tuvo con su cuarto y último matrimonio. Leonardo tuvo así 12 hermanastros , todos mucho más jóvenes que él (la última nació cuando Leonardo tenía cuarenta años), y con los que no tuvo mucha relación pero sí gran cantidad de problemas por la herencia de su padre.
En torno a 1466 asistió al taller de Andrea del Verrocchio, donde se inicia en diversas actividades, desde la pintura de retablos y tablas, hasta la elaboración de grandes proyectos escultóricos en mármol y bronce. En 1472 fue admitido en el gremio de pintores de Florencia, y en 1476 todavía se le menciona como ayudante de Verrocchio, en cuya obra El bautismo de Cristo (c. 1470, Uffizi, Florencia), pintó el ángel arrodillado de la izquierda y el paisaje de matices neblinosos. Su primer encargo fue un retablo para la capilla del Palazzo Vecchio, del ayuntamiento florentino aunque no llegó a ejecutarse.
Pintor sublime, escultor, ingeniero de vanguardia, inventor original, músico, arquitecto innovador, estratega audaz, escritor excéntrico, maestro exigente… está considerado uno de los más grandes genios de la humanidad. Su primera gran obra, La adoración de los Magos (Uffizi), que dejó inacabada, se la encargaron los monjes de San Donato de Scopeto, cerca de Florencia, hacia 1481. Otras obras de este periodo son: la Madonna Benois (c. 1478, Ermitage, San Petersburgo), el retrato de Ginebra de Benci (c. 1474, Galería Nacional, Washington) y el inacabado San Jerónimo (c. 1481, Pinacoteca Vaticana).
En la parte científica se puede ver su interés por los estudios anatómicos del cuerpo humano, basados en las autopsias de cadáveres que realizaba, a pesar de que esta práctica estaba prohibida en el siglo XV. Se cree que pudo diseccionar unos treinta cadáveres con los que dibujó con detalle y claridad gran parte de los órganos del cuerpo.
Leonardo da Vinci fue estrictamente vegetariano, llamó a los omnívoros "devoradores de cadáveres". Parece ser que nunca tuvo relación con mujeres a excepción de su amistad con Cecilia Gallerani. Mantuvo en secreto vida privada. En Florencia, cuando Leonardo era aprendiz de Verrochio, se presentó una denuncia contra el pintor acusándolo de pederasta. Sus protectores consiguieron que eludiera el juicio público.
Su sexualidad ha sido objeto de controversia y parece ser que tuvo relaciones íntimas con sus discípulos Salai y Melzi. En 1476, Leonardo y otros tres jóvenes fueron acusados de sodomía, aunque los cargos fueron desestimados por falta de pruebas. En cualquier caso, Leonardo permaneció soltero y sin hijos.
En 1516 pasó a vivir en Francia, a la corte de Francisco I, donde pasó sus últimos años en el castillo de Cloux, cerca de Amboise.
El 23 de abril de 1519, redactó testamento ante el notario Guglielmo Boreau, manifestando su deseo de ser enterrado en la iglesia de Saint-Florentin, con una ceremonia fúnebre acompañado de capellanes y Frailes Menores, así como 60 personas pobres, cada uno con una antorcha. Leonardo murió el 2 de mayo del mismo año en Amboise, Reino de Francia. Fue enterrado en el claustro de la iglesia de Saint-Florentin en Amboise. Cincuenta años más tarde se violó la tumba y sus restos fueron esparcidos durante la lucha religiosa entre católicos y hugonotes.